Experiência na realização de coloração ácido-rápida de uma bactéria

Experiência na realização de coloração ácido-rápida de uma bactéria para descobrir se é ácido-rápido ou não-ácido-rápido!

Objetivo:

A maioria das bactérias pode ser corada, por simples coloração básica ou por coloração de grama, já que suas células absorvem facilmente as manchas.

No entanto, algumas bactérias possuem uma parede celular cerosa espessa feita de materiais lipídicos.

Tais bactérias são extremamente difíceis de serem coradas, pois manchas aquosas comuns não podem entrar em suas células facilmente, mas uma vez coradas; É igualmente difícil remover a mancha de suas células, mesmo com o uso vigoroso de álcool-ácido como agente de descoloração. Estas bactérias são coradas por coloração ácido-rápida.

Assim, a coloração ácido-rápida, semelhante à coloração de Gram, é um método diferencial de coloração, que diferencia as bactérias, com base na natureza de sua parede celular, em dois grupos, como segue:

(1) Bactérias Ácido-Rápido:

Uma bactéria, que é extremamente difícil de ser corada, mas uma vez corada, é igualmente difícil remover a mancha de suas células, mesmo com o uso vigoroso de ácido-álcool como agente de descoloração, é uma bactéria ácido-rápida bactérias).

Exemplos: Mycobacterium spp. [M. tuberculosis (bactéria da tuberculose), M. leprae (bactéria da lepra), M. smegmatis (bactéria natural da smegma) e M. marinum (bactéria da tuberculose de peixes marinhos). Eles possuem uma parede celular cerosa espessa feita de materiais lipídicos.

(2) Bactérias não ácidas e velozes:

Uma bactéria, que é fácil de ser corada e também é fácil de ser descorada pelo ácido-álcool como agente descolorante, é uma bactéria não ácida e veloz (bactérias que não amam ácidos). Exemplos: Todas as bactérias, exceto Mycobacterium spp. Nestas bactérias, a parede celular não é espessa e cerosa.

A coloração ácido-rápida é útil na diferenciação de bactérias ácido-rápidas e não-ácidas e também na identificação de bactérias pertencentes ao gênero Mycobacterium.

Princípio:

As bactérias ácido-resistentes são diferentes das bactérias não ácidas e rápidas, pois possuem uma parede celular cerosa espessa feita de materiais lipídicos. As manchas aquosas comuns, como o azul de metileno ou a violeta de cristal, não podem entrar nas suas células através desta parede celular cerosa.

No entanto, o corante fenólico de cor vermelha primária fucsina carbol (ácido carbólico ou fenol + fucsina básica); que é solúvel nos materiais lipídicos da parede celular, pode entrar em suas células através da parede celular e pode ser retido dentro das células conferindo-lhes cor vermelha.

A penetração é aumentada ainda mais pela aplicação de calor, que impulsiona o carbol fucsina através da parede lipoidal para o citoplasma. (Uma ligeira modificação deste método de Ziel-Neelsen descreve a adição de um agente umectante, o Turgitol, à mancha, que reduz a tensão superficial entre a parede celular e a mancha, não necessitando, portanto, de aquecimento). As células são deixadas a arrefecer, de modo a endurecer a parede celular cerosa.

Quando as células são expostas ao agente descolorante, ácido-álcool, resistem à descoloração, uma vez que o corante primário é mais solúvel nas ceras celulares do que no agente de descoloração. Subsequentemente, quando contrastado com azul de metileno, não pode entrar nas células através da parede celular cerosa.

Assim, finalmente, as bactérias ácido-resistentes retêm a cor vermelha da mancha primária e aparecem em vermelho. Por outro lado, as bactérias não ácidas-rápidas absorvem facilmente a mancha primária e sofrem descoloração facilmente. Quando contra-coradas com azul de metileno, estas células incolores também absorvem a contra-mancha facilmente e parecem azuis, ao contrário das bactérias ácidas, que parecem vermelhas.

Materiais requisitados:

Slide, loop, corante primário (carbol fucsina), agente de descoloração (ácido-álcool), contra-coloração (azul de metileno), placa quente, caldo / cultura de bactérias / placa / lâmina, microscópio, óleo de imersão.

Procedimento:

1. Um escorregador é limpo adequadamente sob água da torneira, de modo que a água não permaneça como gotas em sua superfície (Figura 5.12).

2. A água aderente é eliminada com papel absorvente e a lâmina é seca ao ar.

3. Um esfregaço de bactérias é preparado no centro da lâmina em dois métodos como se segue.

(a) Se as bactérias cultivadas em placa de agar ou agar inclinado devem ser observadas, uma gota de água é colocada no centro da lâmina e uma alça de bactérias da placa ou inclinação é transferida para ela por uma alça esterilizada sobre a chama. . Então, por rotação lenta do laço na gota, uma suspensão de bactéria é feita e é esparramada até que um esfregaço seja obtido.

(b) Se as bactérias crescidas em caldo líquido devem ser observadas, uma gota da suspensão de bactérias é colocada diretamente no centro da lâmina por um laço esterilizado por chama e um esfregaço é feito por espalhamento.

4. O esfregaço é seco ao ar.

5. O esfregaço é fixado por aquecimento. O aquecimento resulta na coagulação das proteínas celulares, devido às quais as células aderem à superfície da lâmina e não são lavadas durante a coloração. A fixação de calor é feita passando rapidamente o escorregador acima de uma chama 2-3 vezes, com a superfície da mancha voltada para cima, para que o esfregaço não se aqueça.

6. O esfregaço é inundado com fucsina carbol

7. O slide é colocado em uma chapa quente, permitindo que a preparação cozinhe por 5 minutos. A temperatura da placa quente é ajustada de tal forma que a preparação não ferve e evapora rapidamente. A perda de evaporação é reabastecida, para que o esfregaço não seque. (Para o método sem aquecimento, o esfregaço é inundado por 3-5 minutos com carbol fucsina contendo Turgitol).

8. O slide é removido da placa quente e resfriado.

9. O excesso de manchas é removido do esfregaço sob água da torneira, de forma a que a água não caia diretamente no esfregaço.

10. O agente de descoloração, ácido-álcool, é adicionado no esfregaço gota a gota, até que o carbol fucsina não seja lavado do esfregaço.

11. O ácido-álcool é lavado do esfregaço sob água da torneira, de forma a que a água não caia diretamente no esfregaço.

12. O esfregaço é inundado com a contra-mancha, azul de metileno, durante 2 minutos.

13. O excesso de mancha de contraste é lavado do esfregaço sob água da torneira, de forma a que a água não caia diretamente no esfregaço.

14. A lâmina é seca com papel absorvente.

15. A lâmina é presa ao estágio do microscópio e o esfregaço é observado sob baixa potência e altos objetivos secos.

16. Uma gota de óleo de imersão é colocada no esfregaço.

17. O esfregaço é observado sob o objetivo de imersão em óleo.