Experiência para Realizar Gram Coloração de Bactérias (Com Figura)

Leia este artigo para aprender sobre o experimento para realizar a coloração de gram de bactérias para descobrir se é Gram-positivo ou Gram-negativo!

Objetivo:

A coloração diferencial mais importante usada na microbiologia é a coloração de Gram.

É nomeado após o Dr. Christian Gram, que categorizou as bactérias, com base nas diferenças na composição de sua parede celular, em dois grupos, como segue:

(1) Bactérias Gram-positivas:

Após a coloração de uma bactéria com cristal violeta, se a sua parede celular resiste à descoloração por lavagem com um agente de descoloração (etanol ou acetona), é uma bactéria gram-positiva. Exemplos: Bacilo, Staphylococcus.

(2) Bactérias Gram-negativas:

Após a coloração de uma bactéria com cristal violeta, se a sua parede celular permitir a descoloração por lavagem com um agente de descoloração (etanol ou acetona), é uma bactéria gram-negativa. Exemplos: Escherichia, Salmonella, Vibrio.

A diferenciação de bactérias em grupos gram-positivos e gram-negativos fornece a pista mais importante para prosseguir na direção correta para a identificação de bactérias desconhecidas. Também é útil para a diferenciação simples de bactérias em grupos gram-positivos e gram-negativos. Também dá uma ideia sobre a forma e disposição das células das bactérias.

Princípio:

Na coloração de gram, as células bacterianas são primeiro coradas com uma coloração primária, cristal violeta que penetra nas células e as mancha de roxo-azul. Então, as células são tratadas com um mordente, grama de iodo, que entra nas células e se liga à mancha primária formando um complexo insolúvel corante-mordente (cristal violeta-iodo complexo), tornando difícil o escape da mancha.

Depois, as células são tratadas com um agente de descoloração, tal como etanol ou acetona. Atua como solvente lipídico e como agente desidratante de proteínas. Em células gram-positivas, o agente de descoloração atua inicialmente como um solvente lipídico, dissolvendo a pequena quantidade de lipídio presente na parede celular, formando assim minúsculos poros nele. Posteriormente, desidrata as proteínas da parede celular (peptídeos), que fecham os poros.

Agora, o complexo corante é difícil de ser removido pelo agente de descoloração e as células retêm a cor azul-púrpura da mancha primária. Quando contra-corada por uma mancha cor-de-rosa-avermelhada, safranina, não pode entrar nas células, como os poros foram fechados.

As células finalmente retêm a cor azul-púrpura da mancha primária. Por outro lado, a parede celular gram-negativa contém grande quantidade de lipídios (LPS), que é dissolvida pelo agente descolorante, resultando na formação de poros grandes. Estes poros não se fecham sensivelmente na desidratação das proteínas da parede celular.

É por isso que; o complexo mancha-mordente escapa pelos poros, quando lavado pelo agente de descoloração e as células parecem incolores. Quando contra-corada pela safranina, ela entra nas células através dos poros e, finalmente, as células tomam a cor vermelho-rosa da contra-mancha.

Materiais requisitados:

Slide, loop, corante primário (cristal violeta), mordente (grama de iodo), agente de descoloração (95% de etanol), contra-coloração (safranina), caldo / cultura de bactérias / microscópio, óleo de imersão.

Procedimento:

1. Um escorregador é limpo adequadamente sob água da torneira, de modo que a água não permaneça como gotas em sua superfície (Figura 5.11).

2. A água aderente é eliminada com papel absorvente e a lâmina é seca ao ar.

3. Um esfregaço de bactérias é preparado no centro da lâmina em dois métodos como se segue.

(uma) Se uma bactéria cultivada em placa de agar ou agar inclinada for observada, uma gota de água é colocada no centro da lâmina e uma alça de bactérias da placa ou inclinação é transferida para ela por uma alça esterilizada sobre a chama. Então, por rotação lenta do laço na gota, uma suspensão de bactéria é feita e é esparramada até que um esfregaço seja obtido.

b) Se uma bactéria cultivada em caldo líquido deve ser observada, uma gota da suspensão de bactérias é colocada diretamente no centro da lâmina por uma alça esterilizada por chama e um esfregaço é feito por espalhamento.

4. O esfregaço é seco ao ar.

5. O esfregaço é fixado por aquecimento. O aquecimento resulta na coagulação das proteínas celulares, devido às quais as células aderem à superfície da lâmina e não são lavadas durante a coloração. A fixação de calor é feita passando rapidamente a lâmina acima de uma chama 2-3 vezes, com o esfregaço superfície voltada para cima, de modo que o esfregaço não fique aquecido.

6. A lâmina é mantida em uma bandeja de coloração e inundada com a mancha primária, cristal violeta, por 1 minuto.

7. O excesso de manchas é lavado do esfregaço sob água da torneira, de forma a que a água não caia diretamente no esfregaço.

8. O esfregaço é inundado com o mordente, grama de iodo, por 1 minuto.

9. O excesso de mordente é lavado do esfregaço sob água da torneira, de forma a que a água não caia diretamente no esfregaço.

10. O esfregaço é inundado com o agente de descoloração, etanol a 95%, por 5 segundos, com cuidado, para que o esfregaço não seja super-descorado.

11. O etanol é rapidamente lavado do esfregaço sob água da torneira, de modo a evitar uma descoloração excessiva. Cuidado é tomado, para que a água não caia diretamente no esfregaço.

12. O esfregaço é inundado com a contra-mancha, safranina, durante 1 minuto.

13. O excesso de mancha de contraste é lavado do esfregaço sob água da torneira, de forma a que a água não caia diretamente no esfregaço.

14. A lâmina é seca com papel absorvente.

15. A lâmina é presa ao estágio do microscópio e o esfregaço é observado sob baixa potência e altos objetivos secos.

16. Uma gota de óleo de imersão é colocada no esfregaço.

17. O esfregaço é observado sob o objetivo de imersão em óleo.