Animais transgênicos: objetivos da transferência de genes com diferentes métodos de transfecção

Animais transgênicos: objetivos da transferência de genes com diferentes métodos de transfecção!

Um animal transgênico contém em seu genoma, um gene ou genes introduzidos por uma ou outra técnica de transfecção.

O gene introduzido pela transfecção é chamado de transgene. Na transfecção de animais, especifica-se a introdução de um segmento de DNA, seja nu ou integrado em um vetor, em uma célula animal.

Objetivos da Transferência Genética:

1. A modificação genética de animais pode ter como objetivo melhorar a produção de leite, carne, lã, etc.

2. Os genes foram transferidos para animais para obter uma produção em grande escala das proteínas codificadas por estes genes no leite, na urina ou no sangue de tais animais.

3. Um caso especial de transferência de genes visa aliviar ou mesmo eliminar os sintomas e conseqüentes sofrimentos de doenças genéticas. Nesta abordagem, cópias normais e funcionais do gene defeituoso são introduzidas no paciente (terapia gênica).

4. Cepas ou linhagens específicas de animais transgênicos são criadas para atender a necessidades experimentais e / ou biomédicas especializadas.

Métodos de Transfecção:

Várias abordagens têm sido utilizadas para a introdução do DNA em células animais / embriões, que são as seguintes:

(i) Precipitação de fosfato de cálcio.

(ii) microinjeção direta.

(iii) infecção por retrovírus.

(iv) lipofecção.

(v) entrega de armas de partículas e

(vi) Electropoiation.

Precipitação de Fosfato de Cálcio:

Nesta abordagem, a preparao de ADN a ser utilizada para transfeco primeiro dissolvida num tamp fosfato. A solução de cloreto de cálcio é então adicionada à solução de DNA; isto conduz à formação de fosfato de cálcio insolúvel que co-precipita com o ADN. O precipitado de fosfato de cálcio-DNA é adicionado às células a serem transfectadas.

As partículas precipitadas são absorvidas pelas células por fagocitose. Inicialmente, 1-2% das células foram transfectadas por esta abordagem. Mas o procedimento foi agora modificado para obter transfecção de até 20% das células. Em uma pequena proporção das células transfectadas, o DNA se integra ao genoma celular produzindo transfecção estável ou permanente.

Esta abordagem geral pode ser aplicada a virtualmente todas as células de mamífero, e um número muito grande de células pode ser tratado com pouco esforço. Mas muitas linhas celulares não gostam do precipitado de fosfato de cálcio que adere às suas superfícies ou ao seu substrato.

Lipofecção:

A entrega de DNA nas células usando lipossomas é chamada de lipofecção. Os lipossomas são pequenas vesículas preparadas a partir de um lípido adequado. Inicialmente, os lípidos não iónicos foram utilizados para a preparação de lipossomas de modo a que o ADN tivesse que ser introduzido dentro das vesículas seguindo procedimentos de encapsidação específicos.

A utilização de lípidos catiónicos para a construção de lipossomas é uma vantagem distinta, uma vez que o ADN forma espontaneamente e eficientemente complexos com estes lipossomas, tornando desnecessários os procedimentos de encapsidação. Os lipossomas catiicos possuem uma membrana de bicamada lipica ica (unilamelar) e ligam-se eficientemente culas. Provavelmente, eles se fundem com a membrana plasmática e, assim, entregam o DNA (complexado com eles) nas células, o que provoca a transfecção.

A lipofecção é o método de escolha para a transfecção de células de mamíferos in vitro. Também foi usado para entregar DNA em animais vivos por injeção direta ou injeção intravenosa. Os lipossomas catiicos foram utilizados em injeco intravenosa ou intratraqueal em murganhos para a express de genes marcadores em pulms. A distribuio direccionada tamb foi demonstrada por incorporao de proteas de ligando especicas nas membranas dos lipossomas.

Infecção Retroviral:

Os retrovírus recombinantes produzem viriões, que são usados ​​para infectar células animais e embriões de camundongos. O genoma de RNA do retrovírus recombinante é copiado pela transcriptase reversa para produzir uma cópia de DNA (transcrição de receita), que se integra ao genoma da célula. A transcriptase reversa é codificada pelo retrovírus e é produzida imediatamente após a infecção.

Entretanto, a transcrição reversa pode ocorrer apenas naquelas células que passam pela fase S, ou seja, são mitoticamente ativas. A cópia de DNA do retrovírus recombinante integra-se ao genoma celular em locais aleatórios, e geralmente não é acompanhada de deleções ou rearranjos.

Microinjeção:

Nesse método, a solução de DNA é injetada diretamente no núcleo de uma célula ou no pronúcleo masculino de um óvulo fertilizado para o de duas células. Tipicamente, um conjunto de microinjeção consiste em um microscópio de dissecação estereoscópico de baixa potência (para visualizar o óvulo e todo o processo) e dois micromanipuladores, um para uma micropipeta de vidro para segurar o óvulo por sucção parcial e outro para uma agulha de injeção de vidro. DNA no pronúcleo masculino. O pronúcleo masculino é muito maior que o pronúcleo feminino de óvulos de mamíferos fertilizados. No entanto, em óvulos de peixe, o DNA é injetado no citoplasma do ovo.

O procedimento geral para a microinjeção é o seguinte: As fêmeas doadoras são induzidas a super-ovular usando tratamentos hormonais apropriados. As fêmeas superovuladas são então acasaladas com machos férteis, e um grande número de óvulos / embriões fertilizados de uma ou duas células é coletado cirurgicamente. Alternativamente, óvulos não fertilizados são coletados de fêmeas super ovuladas; os óvulos são então fertilizados in vitro. A construção do transgene é preparada em uma solução tampão e é injetada no pronucte masculino de ovos fertilizados usando um conjunto de microinjeção.