HLA: Métodos de teste de histocompatibilidade

Métodos de teste de histocompatibilidade!

O sistema HLA é extensivamente polimórfico. A natureza polimórfica dos alelos HLA foi inicialmente encontrada e definida por métodos sorológicos e os antígenos HLA receberam números. Mais tarde, descobriu-se que antígenos com a mesma especificidade sorológica podem ter diferentes sequências de aminoácidos. Em 1999, o número de alelos HLA conhecidos excedeu 1000 e o número continua aumentando. Por causa do extenso polimorfismo, a nomenclatura dos alelos HLA é complexa e também é difícil para uma pessoa entender a nomenclatura, a menos que a pessoa esteja no campo da histocompatibilidade.

Os primeiros alelos sequenciados receberam nomes com dois dígitos que correspondiam à sua especificidade sorológica. Os dois primeiros dígitos são seguidos por outros dois dígitos que indicam a ordem cronológica de nomeação pelo Comitê de Nomenclatura da OMS para Fatores do sistema HLA. (Por exemplo, o primeiro alelo sequenciado de um gene HLA-A2 foi denominado HLA-A 0201, e o segundo alelo seqüenciado foi denominado HLA-A 0202.)

A tipagem de HLA é feita por métodos de tipagem sorológica ou métodos de tipagem molecular. Os métodos sorológicos de tipagem HLA detectam os epitopos das moléculas HLA, enquanto os métodos moleculares detectam as sequências nucleotídicas.

Eu. A tipagem de HLA que define grupos de alelos (geralmente aproximando-se de especificidades sorológicas) é referida como tipagem genérica ou de baixa resolução (por exemplo, HLA-DRBl-04).

ii. A tipificação que resolve todos os alelos conhecidos é chamada de tipagem HLA de alta resolução (por exemplo, HLA-DR BI x401).

iii. A tipagem que resolve além das especificidades sorológicas, mas que não alcança o nível de alelo, é chamada de tipagem de resolução intermediária (Por exemplo, HLA-DRB140 / 09/13/16/21/26/33).

O National Marrow Donor Program criou um código para facilitar o gerenciamento desses dados complexos de resolução intermediária. Neste sistema, o nome para HLA-BRBl-0401/09/13/16/21/26/23 / é DRBl-04EJV.

Teste de histocompatibilidade por métodos sorológicos:

Os linfócitos são usados ​​para tipagem sorológica de HLA, rastreio de anticorpos e correspondência cruzada.

Isolamento de linfócitos para tipagem HLA:

Eu. O sangue venoso periférico é misturado com Ficoll-Hypaque e centrifugado. A camada contendo células mononucleares do sangue periférico é aspirada, lavada e usada.

ii. Linfócitos isolados dos gânglios linfáticos e do baço de cadáveres são utilizados.

iii. A tipagem de HLA para antígenos de classe II é feita com populações de células B enriquecidas (Aproximadamente 80% das células T normais do sangue periférico são células T em repouso que não possuem antígenos de classe II em sua superfície).

iv. As esferas magn�icas revestidas com anti-CD2 ou anti-CD3 mAb s� utilizadas para isolar c�ulas T; e esferas magnicas revestidas com mAbs anti-CD19 s utilizadas para isolar culas B.

Detecção de Antígenos HLA de Linfócitos:

O ensaio de micro-citotoxicidade é um ensaio de citotoxicidade linfática dependente do complemento. Bandejas de tipagem congeladas contendo poços revestidos com diferentes anticorpos contra antigénios HLA estão comercialmente disponíveis.

Aproximadamente 2000 linfócitos são dispensados ​​em cada poço do tabuleiro e incubados durante 30 minutos à temperatura ambiente. (Anticorpos em cada poço se ligam a antígenos HLA específicos na superfície dos linfócitos, se presentes).

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Cinco µl de complemento (normalmente, soro de coelho) são adicionados a cada poço e incubados por 60 minutos (proteínas do complemento causam a morte de linfócitos que são revestidos com mAbs. Na ausência de ligação de mAb com linfócitos, o complemento não é ativado e os linfócitos não são mortos).

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O corante eosina Y, seguido por formaldeído (formaldeído fixa a reação) são adicionados.

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Em seguida, as células mortas e células vivas em cada poço são contadas sob um microscópio de contraste de fase.

Eu. Células inchadas e escuras são células mortas (o corante eosina Y entra nas células mortas).

ii. Células brilhantes e refratárias são células vivas (o corante eosina Y não entra nas células vivas).

Cada poço na bandeja é visto individualmente para células mortas e células vivas. A porcentagem de células mortas em cada poço é calculada e a pontuação é feita conforme a Tabela 27.5.

Tabela 27.5: Pontuação do teste de citotoxicidade linfática para HLA:

O tipo de HLA de um indivíduo é determinado pela interpretação da reação dos linfócitos do indivíduo com diferentes antissoros usados ​​no teste de citotoxicidade linfática dependente de complemento.

Eu. Espera-se que cada indivíduo tenha dois antígenos HLA-A, dois HLA-B e dois HLA-C na superfície dos linfócitos.

ii. Se um indivíduo apresentar apenas um antígeno HLA-A ou HLA-B ou HLA-C no teste, provavelmente esse indivíduo é homozigoto para aquele antígeno específico ou o painel de antissoros usado no teste não possui o anticorpo específico contra o segundo antígeno. antígeno ou há baixa expressão de moléculas HLA na superfície dos linfócitos.

O ensaio de citotoxicidade por linf�dependente dependente de complemento para os antig�ios HLA-DR e HLA-DQ �realizado utilizando c�ulas B isoladas por esferas magn�icas revestidas com mABs ou c�ulas B isoladas em l�de nylon.

A maioria dos soros de tipagem HLA são obtidos de mulheres multíparas. Como as mulheres mutioparas são repetidamente expostas aos antígenos HLA dos fetos, os soros das multíparas possuem anticorpos contra os antígenos HLA. Quase 200 diferentes antissoros são usados ​​para digitar os antígenos HLA de um indivíduo.

Pensou-se inicialmente que os mAbs para cada um dos antígenos HLA poderiam ser desenvolvidos e a tipagem de HLA seria simples. Mas muitos mAbs ligam-se aos epítopos comuns e não aos epítopos privados dos antigénios HLA. Além disso, muitos mAbs murinos não fixam complemento (e, portanto, seu uso em ensaios de citotoxicidade de linfonodos dependentes de complemento é limitado).

No entanto, os mAbs murinos podem ser utilizados no método ELISA e no método de citometria de fluxo, que não requerem complemento. Ultimamente, muitos laboratórios preferem usar a tipagem molecular de HLA, em vez da tipagem sorológica de HLA.

Rastreando o soro do receptor de transplante para anticorpos contra antígenos de l-ILA (triagem de anticorpos):

A presença de anticorpos para os antígenos HLA no soro de um receptor de órgão transplantado em espera é geralmente feita por citotoxicidade linfática dependente de complemento. Linfócitos com antígenos HLA conhecidos e complemento são misturados com o soro do receptor. Após incubação apropriada, os linfócitos mortos e os linfócitos vivos são contados. O percentual de anticorpo reativo de painel (PRA) é então calculado.

PRA = Número de células positivas / Número total de células do painel x 100

PRA indica a extensão da sensibilização do receptor em espera aos antígenos HLA.

Método ELISA para pesquisar anticorpos séricos HLA:

O método ELISA é fácil, rápido e não requer linfócitos vivos e complemento. Antígenos HLA purificados por afinidade são revestidos nas paredes da placa de microtitulação

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O soro do receptor é adicionado e incubado

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Após a lavagem, a IgG anti-humana conjugada com enzima é adicionada e incubada.

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Após a lavagem, o substrato é adicionado e incubado.

Eu. O desenvolvimento da cor num determinado poço indica a presença de anticorpos IgG contra o antigénio HLA revestido nesse poço particular.

ii. O não desenvolvimento de cor num determinado poço indica a ausência de anticorpos para o antigénio HLA particular revestido nesse poço.

Citómetro de Fluxo para Detectar Anticorpos HLA Séricos:

Micro-pérolas revestidas com antigénios HLA são incubadas com o soro do doente e depois com anticorpos IgG anti-humanos marcados com fluorescência. A porcentagem de gotas que mancham acima do fundo fornece a medida do percentual de anticorpos reativos do painel (PRA) do paciente.

Emparelhamento:

Se o sangue de um receptor em espera contiver anticorpos contra os antígenos HLA do doador, os antígenos HLA nas células doadoras serão atacados pelos anticorpos do receptor, após o transplante. Portanto, antes do transplante, é essencial saber se o receptor possui anticorpos contra os antígenos HLA do doador.

Se os anticorpos específicos do antígeno HLA do doador estiverem presentes no soro do receptor, o transplante será rejeitado. A correspondência cruzada é feita para detectar a presença de anticorpos séricos do receptor em espera contra os antígenos HLA do doador propostos.

Citotoxicidade Linfática Cruzamento com Linfócitos do Sangue Periférico:

Linfócitos do sangue periférico do doador proposto (que contém aproximadamente 80 por cento de células T (que carregam antígenos do MHC classe I) e 20 por cento de células B e monócitos (que carregam antígenos do MHC de classe I e classe II) são misturados ao soro do receptor em espera e incubados .

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O complemento é adicionado e incubado.

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O corante eosina Y é adicionado e incubado.

Eu. O número de células mortas e viáveis ​​é contado e a porcentagem de células mortas é calculada. 50% ou mais de morte celular indicam uma correspondência cruzada positiva forte (ou seja, o soro do receptor tem anticorpos capazes de reagir com antígenos HLA do doador). Um forte cruzamento positivo entre um receptor e um doador proposto é uma contra-indicação para o transplante de órgãos do doador para o receptor.

Para determinar se os anticorpos do receptor são dirigidos contra os antígenos de classe I ou classe II, a correspondência cruzada da citotoxicidade da linfotoxina de células T (usando células T enriquecidas) ou da citotoxicidade da linfotoxicidade de células B (usando células B enriquecidas), respectivamente, é feita.

A correspondência cruzada do citómetro de fluxo é 30-250 vezes mais sensível do que os métodos sorológicos visuais para a detecção de anticorpos IgG contra antigénios HLA na superfície dos linfócitos.

Os linfócitos do sangue periférico do dador proposto são incubados com marcadores marcados (por exemplo, um corante fluorescente que emite luz verde) anti-CD3, que se ligam a células T.

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As células T marcadas com ani-CD3 marcadas são separadas das células B no citómetro de fluxo.

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As células T separadas, coradas, são agora incubadas com o soro do receptor em espera.

Eu. Os anticorpos séricos do receptor contra os antígenos HLA de células T do doador, se presentes, se ligarão às células T.

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Após a lavagem, um flurocromo (que emite uma cor, diferente de verde, digamos, de cor vermelha) marcado com anti-IgG humana é adicionado e incubado.

ii. A IgG anti-humana marcada com florocromo se ligará aos anticorpos HLA do receptor, que estão ligados às células T do doador.

O citômetro de fluxo conta o número de células T (cor vermelha e verde) e células T (cor verde) e cria um histograma.

Correspondência Cruzada para Autoanticorpos contra Linfócitos:

Durante uma correspondência cruzada, os autoanticorpos contra linfócitos no soro do receptor podem se ligar não especificamente aos linfócitos doadores e dar um resultado de correspondência cruzada falso-positivo; e consequentemente, o doador é erroneamente desqualificado de doar órgãos para o receptor em particular. Os auto-anticorpos também podem mascarar a presença de anticorpos específicos anti-dador.

A presença de autoanticorpos contra os linfócitos é detectada pela auto cross-match, na qual os linfócitos e soro do próprio receptor são combinados em um teste padrão de citotoxicidade. As correspondências cruzadas de autoanticorpos são realizadas rotineiramente em conjunto com todas as correspondências de cruzes de doador vivo para cada soro testado.

Métodos de Biologia Molecular para Tipagem de HLA:

A maioria dos métodos de tipagem molecular utiliza a técnica de reação em cadeia da polimerase (PCR) para amplificar seletivamente os segmentos do gene HLA necessários para a digitação.

Digitação específica por sequência (SSP) Digitação:

O DNA do indivíduo é extraído de células ou tecidos

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O DNA é adicionado aos tubos contendo diferentes conjuntos de primers para diferentes genes HLA. Um conjunto adicional de primers é incluído como um controle positivo de amplificação em todos os tubos.

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Os outros componentes da reação de PCR (como nucleotídeos de DNA, DNA polimerase, buffer) são adicionados e a ciclagem térmica é realizada.

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Os produtos amplificados são submetidos à eletroforese em gel com brometo de etídio e fotografados sob luz UV.

Eu. Presença de banda indica que a amostra de DNA tem a sequência correspondente ao tipo particular de HLA.

ii. Ausência de banda indica que a amostra de DNA não contém a seqüência particular do tipo HLA.

iii. A banda interna de controle de amplificação deve estar presente para interpretação.

Conjuntos de primers para tipagem de HLA estão comercialmente disponíveis.

Eu. Para HLA-A, B e C, são necessárias cerca de 100-200 reações.

ii. Para HLA-DRB, são necessárias cerca de 20 a 30 reações.

Hibridação da Sonda Oligonucleotídica Específica da Sequência (SSOP):

O método SSOP envolve a amplificação seletiva do alvo HLA seguido por hibridização a um painel de sondas oligonucleotídicas. Existem dois formatos SSOP.

Eu. Dot ou slot blot:

O DNA amplificado está ligado ao suporte sólido (como a membrana de nylon) e a sonda de hibridização está em solução.

ii. Ponto reverso ou mancha blot:

A sonda é ligada ao suporte sólido e hibridizada ao DNA amplificado em solução.