Teste de utilização de citrato para verificar a capacidade de uma bactéria para utilizar citrato como fonte de carbono

Objetivo de realizar o teste de utilização de citrato, para descobrir a capacidade de uma bactéria para utilizar citrato como única fonte de carbono.

Princípio:

Algumas bactérias têm a capacidade de crescer em meios sem C e N. orgânicos.

Eles podem utilizar citrato de sódio como única fonte de C e di-hidrogenofosfato de amônio (NH ₄ H ₂ P 0 ₄ ) como única fonte de N. Eles utilizam NH ₄ H ₂ P ₀ ₄ para obter N com produção de NH ₃, o que aumenta a pH resultando em uma mudança na cor do azul de bromotimol de verde (pH = 6, 9) para azul (pH acima de 7, 6).

No teste de utilização de citrato, as bactérias de teste são cultivadas em agar slants contendo não C ou N orgânico, contendo antes citrato de sódio, NH4H2P04 e azul de bromotimol. Se a bactéria tem a capacidade de utilizar citrato como única fonte de C, ela mostra crescimento nas inclinações. Ele também utiliza NH ₄ H ₂ P 0 ₄ como a única fonte de N resultando em uma mudança na cor das inclinações de verde para azul.

Materiais requisitados:

Tubos de ensaio, frasco cônico, tampões de algodão, agulha de inoculação, autoclave, bico de bunsen, câmara de fluxo laminar, jarra de descarte, incubadora, ágar citrato Simmons, colônias isoladas ou culturas puras de bactérias.

Procedimento:

1. Os ingredientes do meio de cultura de citrato de Simmons (contendo citrato de sódio, NH ₄ H, P 0 ₄ e azul de bromotimol como principais ingredientes) ou o pó pronto para 100 ml do meio são pesados e dissolvidos em 100 ml de destilado água num balão cónico de 250 ml, agitando e agitando (figura 7.6).

2. Seu pH é determinado usando um papel de pH ou medidor de pH e ajustado para 6, 9 usando 0, 1N HC1 se é mais ou usando 0, 1N NaOH se for menor.

3. O balão é aquecido para dissolver completamente o ágar no meio.

4. Antes de solidificar, o meio em estado de fusão quente é distribuído em 5 tubos de teste (aproximadamente 20 ml cada).

5. Os tubos de ensaio são revestidos de algodão, cobertos com papel craft e amarrados com fio ou elástico.

6. Eles são esterilizados a 121 ° C (15 psi de pressão) por 15 minutos em autoclave.

7. Após a esterilização, eles são removidos da autoclave e mantidos em uma posição inclinada para resfriar e solidificar o meio, de modo a obter agar de citrato inclinado.

8. A bactéria de teste é inoculada assepticamente, preferivelmente em uma câmara de fluxo laminar, nas inclinações, perfurando a parte superior e estriando na superfície das lâminas com a ajuda de uma agulha esterilizada por chama. A agulha é esterilizada após cada inoculação.

9. As lâminas inoculadas são incubadas a 37 ° C por 24 a 48 horas em uma incubadora.